医院诊室及手术室消毒常规采用紫外线照射或甲醛熏蒸。但紫外线辐射有局限性，容易形成消毒死角，且其直接照射到人体，易引起电光性眼炎和皮肤红斑。而甲醛蒸汽法消毒时间长，残余气体对人体有害。因此，这2种消毒方法对设备多、气雾污染严重、人员流动频繁的口腔科诊室消毒均不尽人意。臭氧(0 )属强氧化性气体，具有广谱杀灭微生物的作用，其流动性佳且终产物为氧气与活性氧，无二次污染．将其用于口腔诊室消毒应优于紫外线与甲醛。目前．在发达国家，臭氧已广泛用于水产养殖、食品加工、医药等领域[Zl。虽然国内外也有许多关于臭氧抗菌方面的报道，且已有臭氧治疗机用于龋病的治疗，但尚未见臭氧用于口腔诊室消毒的报道。本实验在口腔诊室空气采样分析的基础上，选择诊室内较多见的4种细菌为实验对象，探讨不同浓度的臭氧对4种细菌的灭活效果及可用于口腔诊室消毒的臭氧浓度范围与有效作用时间。

1 材料与方法
1．1 材料
    参照我科诊室空气采样分析结果，选用诊室内较多见的4种细菌为实验对象．其中2种为国际标准菌株：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus oltreus1AT-CC29573、变形链球菌(Streptococcus muto2~1ATCC25175，2种为临床分离菌株：表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis1、 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)。菌种均由上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔微生物实验室提供。其他主要材料与器械有Tryptone (Oxold公司1，Polypeptone(日本制药株式会社1，PEM008电解式臭氧发生器(浙江温州康桥环保设备有限公司)，GS一罗马数字三B大气采样器(上海宏宇环保应用研究所)，ER一182A电子分析天平(日本1，OLYMPUS高倍光学显微镜(日本1、UV一1601分光紫外光度计(日本)、WMZK一10厌氧培养箱(浙江义乌)，XW一80A漩涡混合器(上海)，SW—CJ—IFD型净化工作台(苏州)。

1．2 方法

1．2．1 臭氧浓度的测定 分别打开臭氧发生器的
    不同机组．并通入lm3大小的安全密封柜内，至预定时间．用大气采样器以100ml／min的流速采集臭氧5rain，通入200g／L的碘化钾吸收液中，加3mol／L的硫酸5m1．混匀，置暗处10min。然后加5g／L淀粉指示剂2m1．用0．01mol／L硫代硫酸钠标准溶液滴定至无色即为终点。重复测定3次，取平均值根据以下公式计算臭氧浓度：CO =ANaxBx24000／V0(mg／L)。其中，CO广臭氧浓度(mg／L)；ANa一硫代硫酸钠标准溶液用量(m1)；B一硫代硫酸钠标准溶液浓度(mol／L)；V。— — 臭氧化气体取样体积(m1)。
1．2．2 菌液的制备将厌氧培养18h(90％ N ，10％CO ，37~C)保存之细菌复苏，经生化鉴定后，接种于乳酪消化大豆胨琼脂平板fSA1，挑取琼脂表面的单个菌落，混悬于相应液体培养基(胰蛋白大豆肉汤)中(1个lmm 菌落／ml1，培养18 h后，将菌液充分震荡摇匀．用紫外分光光度仪调整其OD值(k=540nm)为0．13．作为实验菌液备用。
1．2．3 载体定量杀菌试验 用微量加样器吸取每种菌液10 l，分别滴染于5片10mmx10mm大小已高温、高压消毒的玻璃片上，37℃干燥30min．制成菌片备用。将3片相同菌种的菌片放入lm3安全玻璃柜内，分别打开臭氧发生器的1组、2组、3组机电，各作用至15min、30min、45min后，取出菌片．放入含5ml 0．03mol／L磷酸盐缓冲液的无菌试管中．在漩涡混合器上振荡lmin，洗脱菌片上的细菌，各取洗脱液50 ，接种于TSA平板。对照组为未经臭氧处理的同批菌片，相同条件下放置规定时间后，用相同方法洗下细菌，接种于TSA平板。将所有平板放入厌氧箱(90％ N2，10％ CO2，37~C)培养24～48h后，进行活菌菌落计数，计算杀灭率，实验重复3次。杀灭率=(对照组一试验组1，对照组×100％。
1．3 统计学处理
    所得数据采用SAS 6．12软件包进行x 检验，P<0．05为有统计学意义。

2 结果

2．1臭氧浓度
    根据碘滴定法，测得臭氧浓度最低为0．24mg／L，最高可达2．73mg／L，见表1。



2_2 载体定量杀菌试验
    臭氧对金黄色葡萄球菌、变形链球菌、表皮葡萄球菌和肺炎链球菌均有明显的杀菌效果。当臭氧浓度一定时．各组细菌灭活率均数之间差异无显著性(P>0．05)；打开1组臭氧机组时，15min、30min和45min各组灭活率均数之间差异均有显著性(P<0．051；打开2组或3组时，30min与45min组灭活率之间差异无显著性(P>0．051，15min分别与30min、45min组灭活率之间差异有显著性(P<0．051。当作用时间不变时，各个臭氧浓度组灭活率之间差异有显著性(P<0．051；作用时间为15min时，打开臭氧1组与2组及2组与3组灭活率之间差异无显著性（P>0．051，1组与3组灭活率之间差异有显著性(P<0．051．金黄色葡萄球菌、变形链球菌和肺炎链球菌组灭活率之间差异无显著性(P>0．05)，表皮葡萄球菌与其余各组杀灭率之间差异均有显著性(P<0．051；时间为30min和45min时。打开臭氧2组与3组机组杀灭率之间差异无显著性(P>0．051。1组分别与2组、3组杀灭率之间差异有显著性(P<0．05)，见表2。



3 讨论
    臭氧(03 )在常温下为无色气体，是由3个氧原子构成的分子。它是一种活性氧。具有很强的氧化性。可自行分解成稳态的氧分子(0 )和单个新生态氧原子(O)。单个氧原子具有极强的氧化性，其强氧化作用能杀灭多种致病微生物，而多余的氧原子在30min后又会转化成稳态的氧分子，不会产生有毒残留物。目前，多数学者认为臭氧灭活微生物的机制是通过生物化学氧化反应而影响生物细胞中物质的交换。具体灭活机制可能有以下3种形式：① 臭氧能氧化分解细菌细胞内部的葡萄糖氧化酶：②臭氧直接与细菌、病毒发生作用，破坏其细胞内DNA和RNA．分解蛋白质、脂质类和多糖等大分子聚合物，使微生物的新陈代谢和繁殖过程遭到破坏；③臭氧能渗透细胞膜组织，穿入菌体内部，侵入细胞膜，作用于外膜脂蛋白和内部的脂多糖．使细胞发生通透性畸变。导致细胞溶解死亡．并且使死亡菌体内的遗传基因、寄生菌种、寄生病毒粒子、噬菌体、支原体及热原等溶解变性而死亡。Wells等认为，臭氧对病毒的作用可能是先损伤病毒的衣壳蛋白上的4条多肽链，进而使RNA受损。戚仕涛等通过电镜观察到。噬菌体被臭氧氧化后，其表皮破碎成许多碎片，并从中释放出许多核糖核酸．这些核糖核酸会干扰吸附到寄存体上。杨华明等则认为。臭氧通过破坏核糖核酸或脱氧核糖核酸完成对病毒的灭活。
    臭氧的杀菌作用受几种因素的影响。普遍认为臭氧的浓度、作用时间、环境温度及湿度与其杀菌效果呈正相关关系。李洪敏等的实验表明．用0．92mg／L的臭氧熏蒸20min。对空气中金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌和结核分枝杆菌的杀灭率分别为93．45％ 、93．45％ 、90．00％和96．00％。刘衡川等发现．当臭氧浓度达774．7mg／m3时．对枯草杆菌黑色变种芽孢作用120min．杀灭率达100％ ；对不锈钢片上乙型肝炎表面抗原(HbsAg)作用60min．也可将其抗原性完全破坏。温度不仅影响灭菌的化学反应过程。也会影响臭氧分子的存在时间。虽然温度越高．杀菌速度越快．但高温时臭氧分子会快速分解．易失去杀菌作用。王东黎等㈣报道．在室温25℃时．相对湿度为40％和70％条件下．同样开机消毒2h．臭氧对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀灭率分别从90．5％和92．4％提高到100％ ：对白色念珠菌的杀灭率从86．0％提高到99．93％ ；在相对湿度为40％时．开机消毒6h不能破坏HbsAg抗原性．相对湿度提高到70％．HBsAg抗原性可完全被破坏。因此．利用臭氧消毒也要注意以上因素。
    Nagayoshi等利用臭氧水(4mg／L,lOs)处理人口腔发现．几乎所有微生物均被抑制．而对变形链球菌更是有即刻杀灭效果。Baysan等发现．用臭氧气冲10～20s，根面龋内微生物亦会大幅度减少。但目前文献报道用臭氧治疗或消毒的有效浓度及处理时间均无统一的标准。本实验表明。当时间固定时，
随着臭氧浓度的增加。其杀菌效果也逐渐增强。臭氧浓度为2．73mg／L、作用45min后，其对金黄色葡萄球菌、变形链球菌、表皮葡萄球菌和肺炎链球菌的杀灭率均达100％。我们的另一试验证实，在这一浓度与时间下。臭氧对4种常见真菌也有同样效果。如仅从院内细菌与真菌感染控制及空气质量要求考虑．开启3组臭氧发生器消毒45min应能达到目的。但医院诊室空气与物件表面还会有病毒存在，臭氧对其杀灭效果如何．有待进一步探讨。